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western抗體孵育時(shí)間您知道嗎

更新時(shí)間:2023-06-29      瀏覽次數(shù):7342

western抗體孵育時(shí)間您知道嗎


我們來看看不用的老師不同的意見:


老師一:

  1. 首先建議仔細(xì)查看抗體試劑的說明書,全面掌握孵育的時(shí)間和溫度等條件,考慮使用同一個(gè)廠家的配套試劑。

2.每一種試劑作用之后的洗滌過程,都需要標(biāo)準(zhǔn)操作,用力過猛或時(shí)間過久可能導(dǎo)致假陰性反應(yīng),而洗滌時(shí)間過短、沖洗不充分會(huì)導(dǎo)致假陽性反應(yīng)。

3.設(shè)置陽性對照,監(jiān)控抗原抗體反應(yīng)和顯色的過程,以便分析結(jié)果和過程中可能存在的問題。


老師二:

一抗孵育溫度有幾種:4度、室溫、37度,其中4度效果佳;孵育時(shí)間與溫度、抗體濃度有關(guān),一般37度1-2h,4度過夜(從冰箱拿出后37度復(fù)溫45min)。具體條件還要摸索。二抗一般室溫或37度30min-1h,濃度一般有工作液,若是濃縮液還要摸索濃度。

孵育時(shí)間過長非特異性條帶顯現(xiàn)的可能增加


老師三:

一抗的孵育時(shí)間與溫度、抗體濃度有關(guān)。一般情況下,在37℃的條件下,孵育1-2小時(shí)左右。在室溫的條件下,孵育3小時(shí)左右。在4℃的條件下,孵育18-24小時(shí)左右。如果一抗的濃度過高或者是孵育時(shí)間過長,會(huì)導(dǎo)致非特異性吸附,增加洗滌的難度,最終因洗滌不徹而出現(xiàn)非特性顯色。


老師四:

western blot 一抗孵育時(shí)間過長當(dāng)然有影響的,一抗孵育時(shí)間太長容易導(dǎo)致非特異性吸附加深

一般可以室溫孵育三十分,然后四度過夜?;蛘哌x擇室溫孵育2小時(shí)直接二抗。因?yàn)橄茨は慈サ氖俏唇Y(jié)合的抗體,抗體結(jié)合上就不容易洗掉了。洗膜不背景會(huì)深,但洗膜時(shí)間延長并不能去除背景。


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